龙为总督，率军平叛，马千乘奉命率领三千白杆兵出征。秦良玉虽为女子，却主动请缨，率领五百精兵押运粮草，与副将周国柱一同扼守邓坎（今贵州省凤冈县南），成为丈夫最坚实的后盾。
次年正月，杨应龙趁李化龙大军在营中设宴庆功之际，突然发动袭击，营中顿时一片混乱。危急时刻，秦良玉与马千乘挺身而出，率领白杆兵奋勇杀敌。秦良玉手持长枪，跃马冲锋，所到之处，叛军无不胆寒。夫妻俩率领士兵乘胜追击，接连攻破金筑关等七个营寨，为平叛之战立下汗马功劳。而后，他们又协助酉阳官军攻取桑木关，彻底击溃杨应龙的主力。此役中，秦良玉战功位列南川路第一，可当朝廷论功行赏时，她却只字不提自己的功绩，将功劳全归于麾下将士与丈夫。
然而，命运却对这位巾帼英雄格外苛刻。万历四十一年（1613年），马千乘因不愿迎合太监邱乘云的索贿，被其诬告谋反，打入云阳监狱。狱中条件恶劣，马千乘本就征战多年，身体留有旧伤，竟在狱中一病不起，最终含冤而逝。彼时，他们的儿子马祥麟年仅十岁，无法承袭土司之职。为了守住马氏家族的基业，为了不让麾下三千白杆兵溃散，秦良玉强忍丧夫之痛，以女子之身，正式代领石柱宣抚使一职，成为大明历史上少有的女土司。
掌权后的秦良玉，并未因悲痛而消沉。她严格治军，号令严明，将白杆兵训练得更加精锐。同时，她轻徭薄赋，安抚百姓，石柱在她的治理下，呈现出一片安定祥和的景象，与周边战乱频发的地区形成鲜明对比。
泰昌元年（1620年），后金（清朝前身）大举入侵辽东，明军节节败退，朝廷急诏各地土司出兵援助。秦良玉接到诏令后，毫不犹豫地派兄长秦邦屏、弟弟秦民屏率领五千白杆兵先行出征。朝廷为表彰她的忠义，赐其三品官员服饰，并任命秦邦屏为都司佥书，秦民屏为守备。
天启元年（1621年），后金大军包围辽东重镇沈阳，秦邦屏、秦民屏随总兵童仲揆渡浑河，与后金兵展开血战。白杆兵虽装备简陋，却个个奋勇争先，用手中的白杆枪与后金的铁骑展开殊死搏斗，斩获敌首数千级，让不可一世的后金兵第一次尝到
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