因的真相大白，另一重迷雾却接踵而来。既然光绪帝是中毒身亡，那么到底是谁那么大胆，竟然敢向一国之君投毒呢?
对这个凶手，学者们各持各的观点，给出了很多种答案。
第一个怀疑对象，当仁不让的就是那位大名鼎鼎的慈禧太后。毕竟看慈禧太后对待光绪帝的态度，只做傀儡，而无丝毫感情，后来更是囚禁了光绪帝。既然是她下令囚禁了光绪帝，那么把守之人皆为她的亲信，要毒死光绪帝，她有动机，也有手段。
据《崇陵传信录》和《清稗类钞》两本书指出：“慈禧太后病危期间，曾犹豫对光绪帝要如何处置，遂以自己不久人世的消息透露给光绪帝知道，惟其近侍回报，帝曾微露喜色”
慈禧太后怕自己死后，光绪帝翻案，因此想要在自己死前，解决掉光绪帝，断绝可能。清室后裔、书法家启功指出，其曾祖父、时任礼部尚书的溥良曾亲眼看到太监从病重的慈禧宫中传出一个盖碗，称“是老佛爷赏给万岁爷的塌喇”。而在这位“塌喇”送去不久，本无大病的光绪帝却驾崩了。
第二个可疑人选，就是那个在光绪帝维新变法之际，背叛光绪帝的袁世凯。因为他的背叛，另光绪帝彻底的怨恨上了他。光绪帝被囚禁在瀛台之时，“日书项城(指袁)名以志其愤”。袁世凯自然知道光绪帝对自己的痛恨，如今太后弥留之际。若是太后去世，光绪帝自然就翻了身，到时候绝对不会放过他，所以才铤而走险，出此下策。
不过此种说法，也有人提出异议。毕竟当时袁世凯已经被开缺回籍，远在河南安阳。且按照清宫内廷制度，任何从宫外送入御用的食物必须先经人试毒。因此即使袁有动机，也不大可能有机会对光绪帝下毒手。袁更不可能在有机会篡改清实录和脉档，制造光绪帝病死的假象。所以最大的可能，其实还是慈禧太后毒死了光绪帝。
《清史稿》论曰：德宗亲政之时，春秋方富，抱大有为之志，欲张挞伐，以前国耻。已而师徒饶败，割地输平，遂引新进小臣，锐意更张，为发奋自强之计。然功名之士，险躁自矜，忘投鼠之忌，而弗恤其罔济，言之可为于邑。洎垂帘再出，韬晦瀛台。外侮之来，衅自内作。卒使八国连
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